▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-6. Primary antibody (1st Ab)
- 1-7. Secondary antibody (2nd)
2. Products
1-9. Stripping / Reprobing
WB membrane의 Stripping/Reprobing은 단일 Membrane내에서 여러 단백질 표적을 검출하기 위한 시간 효율적인 방법을 제공합니다. 이 방법을 사용하면 단일 Membrane에서 다양한 분석이 가능하므로 시간, 시료 및 소모품을 절약하고 효율성을 극대화할 수 있습니다. 또한 Membrane이 1차 항체만으로 직접 검출이 필요할 경우, 관심 있는 단백질의 초기 분석 결과를 재확인할 필요가 있는 경우, 즉 같은 단백질에 대해 초기 검출에 사용했던 1차 항체와 다른 Epitope에 결합하는 또다른 1차 항체로 재확인할 필요가 있는 경우에도 매우 유용합니다.
1980년대 초에 처음 개발된 이 방법은 Urea, b-MCE/BSA buffer 또는 강산성의 Glycine buffer를 고온에서 장시간(경우에 따라 최대 1시간)처리하여 표적 단백질로부터 1차 항체와 검출시약을 제거했습니다. 이후, Stripping buffer는 빠르게 발전하여 실온에서 좀 더 순한 조건(일반적으로 SDS, Glycine 및 Detergent의 혼합물로 구성된 TBST)에서 표적 단백질의 손상을 줄이기 위한 방법이 개발되어 왔으며 상업적으로 공급하는 것들도 있습니다.
Stripping/Reprobing은 일반적으로 동일한 단백질의 총 발현량을 평가하기 전에 인산화된 단백질의 수준을 조사하기 위해 흔히 수행되며 단백질의 신호 전달 능력대비 활성화의 비교평가에 유용합니다. 이렇게 하면 일반적으로 표적 단백질의 총 발현량을 검사하기 앞서서 약하게 발현되는 Phospho-protein을 먼저 정확히 측정하는 것이 가능합니다.
Membrane에서 항체 Stripping 및 Reprobing의 명백한 이점에도 불구하고 이러한 방법이 항상 완벽한 것은 아니며 상당한 제한이 있을 수 있습니다.
이러한 Stripping/Reprobing 방법을 적용하는데 있어서는 늘 세심한 주의를 기울여야 하며 조건은 항상 최적화 되어야 합니다. 또한 Stripping/Reproving에 의해 항원의 손실 가능성이 생긴다면 실제로 잘못된 측정으로 이어질 수 있으므로 이 작업이 후속 정량화에 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것도 입증해야 합니다. 이것은 단백질 발현의 변화가 작거나 점진적일 때 (즉, 시간 경과에 따른 발현량 변화) 더욱 두드러집니다. 결국 동일한 Blot 내에서 동일한 단백질에 대한 인산화 및 총량을 모두 측정할 때의 장점에도 불구하고 한계가 이점보다 클 수 있으므로 Membrane에서 항체를 제거하고 Reprobing하는 것이 적절한지 여부를 고려해야 하며 결과적으로 WB의 정확한 검출 및 정량화 데이터는 Stripping/Reprobing보다는 단순히 WB 전 과정을 반복하는 것이 더 바람직할 수 있습니다.