▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-6. Primary antibody (1st Ab)
- 1-7. Secondary antibody (2nd Ab)
2. Products
1-10. Analysis
표적 단백질의 분석은 검출 방법 및 사용 가능한 이미징 시스템에 따라 달라지며, 많은 이미징 시스템에는 이미지 수집 및 정량화를 위한 소프트웨어가 필요합니다. 각 소프트웨어 패키지는 정량화를 위해 약간 다른 방법을 사용하지만 일반적으로 피크 높이나 면적이 사용됩니다. 발현량이 매우 높은 단백질의 경우 정량화 과정에서 이미징 센서의 Pixel saturation이 발생할 수 있으므로 Target band가 선형 감지 범위 내에 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 이것은 매우 일반적인 오류이며 쉽게 피할 수 있고, 최근 시스템에 있어 Saturation 자동 감지는 이제 대부분의 이미징 패키지에서 표준 기능입니다. 그럼에도 불구하고, 매우 풍부한 단백질(ex. GAPDH)에 대한 화학 발광 검출 동안 Membrane의 Over saturation "Staining" (즉, 노출 전에 Membrane에 눈에 보이는 노란색 Band로 표시됨)이 발생할 수 있으므로 이 경우에는 Sample Loding volume을 줄이거나 1차 항체의 희석 배율을 높여야 합니다.
정량화를 위한 또 다른 중요한 고려 사항은 단일 Band 또는 전체 Lane에 대한 박스형 분석을 선택하는 것입니다. 전자는 개별 단백질 분석에 적합하고 후자는 전체 단백질 변화의 검출에 더 적합합니다. 단일 Band 분석은 Target band를 결정하기 전에 샘플 Lane을 식별하여 간단히 수행되는 반면 전체 Lane 분석은 지정된 영역내에서 개별 Band의 강도를 측정합니다. 어떤 방법을 선택하든 Lane 당 동일한 분석 영역을 사용하여 측정 Target band 전체에 걸쳐 일관성을 유지해야 합니다.
그렇지 않으면 다른 Volume (분석 상자 영역의 크기)이 분석되어 잠재적으로 왜곡된 데이터를 생성합니다. WB 조건은 가능한 가장 선명한 Band를 생성하도록 최적화되었지만, 눈에 보이지 않는 Background가 여전히 발생할 수 있으며 데이터 분석 시 이를 빼주는 것이 필요합니다. 원칙적으로 이것은 피크 값에서 계산된 Background intensity를 빼서 이루어지며 이를 통해 분석된 데이터들이 표적단백질의 실제 발현량을 반영할 수 있어야하고 선형 측정범위내에 있도록 설정되어야 합니다.