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1. Introduction▶ 2. Western Blot       - Sample preparation     3. Products   2. Sample preparation(3) 세포 분획화 및 면역 침전 특정 세포 분획(Membrane, Nucleus, Mitochondria 등)을 분리하는 것은 일반적으로 Plasma membrane protein, DNA binding protein 등 세포내 특정 위치에 분포하는 단백질을 분석하기 위한 과정으로 이를 위해 추가적인 Buffer 구성이나 Sample 처리 과정이 필요할 수 있습니다. (ex. 일반적으로 Mitochondria의 분리는 Mitochondria의 형태를 보존하고 막 파괴를 최소화하기 때문에 Dounce homogenizer를 사용합..

1. Introduction▶ 2. Western Blot       - Sample preparation     3. Products   2. Sample preparation(2) Protein extraction options○ Detergent-based Lysis 동물 세포의 용해에 가장 자주 이용되는 방법으로 세포 현탁액을 가볍게 원심분리한 후 Detergent가 포함된 Lysis solution에서 재 현탁 시키는 간단한 과정입니다. 이때 세포를 보호하던 세포막이 용해되고 내부의 세포 구성물들이 방출되게 됩니다. Fibroblast와 같은 부착성 세포의 경우 간단하게는 배양용기 내에서, 또는 Cell scraper 등으로 긁어모아 Tube에 옮긴 뒤 원심 분리 과정을 거친 후 Lysis so..

1. Introduction▶ 2. Western Blot       - Sample preparation     3. Products   2. Sample preparation (1) Extraction buffer Sample은 표적 단백질을 가용화하고 보존에 최적화하도록 조성된 완충액에서 균질화되어야 합니다. 단백질의 등전점(중전하를 띠는 pH)에 근접한 균질화 용액을 정확하게 완충(pH 7-9)하도록 하여 아미노산의 활성 잔기의 양전하 또는 음전하를 정확하게 유지함으로써 용해도를 높이고 단백질 침전을 방지하기 위해 필요합니다. Nonionic detergent(ex. Triton X-100)의 사용은 비극성 불용성 단백질의 용해도를 증가시키는 데 유리합니다. 일반적으로 단백질의 정확한 3차 또는 ..

▶ 1. Introduction     2. Western Blot     3. Products   1. Introduction  Western blot(WB)는  단백질 발현과 조절, Kinase 활성, 세포 내에서의 위치, 단백질-단백질 상호작용 또는 Translation 후 변형등 세포 대사와 조절, 단백질 기능과 관련된 현상들을 분석하는데 광범위하게 사용됩니다. 최근 WB이 다양한 분야에 확장 응용되고 있는 반면, 이 기술에 대한 생화학적 분석 지식이 부족한 사용자 수가 증가함에 따라, WB에 관련된 많은 이론적, 기술적 요인들을 간과하여 부정확한 데이터 생성 및 해석으로 연결될 가능성도 커졌습니다. Western blotting 과정은 좁은 의미로는 Gel에서 보다 안정적인 Matrix인 Mem..

Western blot을 위해 Membrane으로 Transfer된 단백질들은 비특이적 항체 결합을 방지 하기 위해 Blocking 과정을 거칩니다. Blocking buffer 제작 시 BSA, Skim milk등의 동물성 단백질을 직접 제작하거나 구매하여 사용하지만 직접 제작할 경우에는 BSA, Skim milk의 변성이 빠르게 일어나 항상 냉장 보관을 하여도 장기간 보관이 어렵고 기성품을 이용하더라도 Sodium azide 등의 보존제가 첨가되어 항원-항체 반응을 방해하여 원활한 Western blot을 방해합니다. BIOMAX 사의 Smart-Buffer™ BSA or Skim Milk Blocking Buffer는 특수 제작된 보존제를 이용하여 단백질의 오염으로 인한 변성을 예방하며 상온에서도 ..

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