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[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 1-10. Analysis

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer       - 1-5. Blocking       - 1-6. Primary antibody (1st Ab)       - 1-7. Secondary antibody (2nd Ab)       - 1-8. Detection       - 1-9. Stripping / Reprobing 2. Products   1-10. Analysis  표적 단백질의 분석..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer       - 1-5. Blocking       - 1-6. Primary antibody (1st Ab)       - 1-7. Secondary antibody (2nd)       - 1-8. Detection 2. Products   1-9. Stripping / Reprobing  WB membrane의 Stripping/Reprobing은 단일..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer       - 1-5. Blocking       - 1-6. Primary antibody (1st Ab)       - 1-7. Secondary antibody (2nd) 2. Products   1-8. Detection  WB 검출의 일반적인 원리는 Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)와 같은 여러 항체 기반 분..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer       - 1-5. Blocking       - 1-6. Primary antibody (1st Ab) 2. Products   1-7. Secondary antibody (2nd Ab)  2차 항체(2nd Ab)는 1st Ab에 의해 결합된 표적 항원의 간접 검출에 필요합니다. 일반적으로 1차 항체는 검출을 위한 Label (ex. Horseradi..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer        - 1-5. Blocking 2. Products   1-6. Primary antibody (1st Ab)  WB의 원리는 하나 이상의 표적에 대한 항체(Ab)의 인식 및 결합을 통해 단백질을 검출하는 것입니다. 이 상호작용은 항원(Protein)의 일부(Epitope)와 항체의 항원 결합 영역(Fab)에 존재하는 특이적 인식 부위(Parat..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer     2. Products   1-5. Blocking  WB을 수행 시 Blocking step은 항체(1st Ab 또는 2nd Ab)와 Membrane의 비특이적 결합을 방지할 수 있는 매우 중요한 과정입니다. Membrane은 Sample 단백질뿐만 아니라 항체와 같은 결합 단백질에 대해서도 높은 친화성을 갖기 때문에 적절한 Membrane bloc..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)       - 1-4. Electrotransfer     2. Products   1-4. Electrotransfer  Gel 상에서 분리된 단백질은 항체를 이용하여 검출하는데, 이를 위해 단백질에 대한 높은 친화력과 내구성을 가지는 Membrane으로 전기적 힘을 이용하여 단백질을 이동 및 고정시킵니다. PAGE와 동일한 원리를 이용하여, Gel에 음으로 하전된 단백질은 Buffer에 담근 상태에서 측..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading       - 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)     2. Products   1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)  앞선 샘플 준비 단계에서 2차, 3차 구조가 변성되고 분자량에 비례하여 음전하를 띠도록 준비된 단백질 Sample들은 PAGE를 수행하여  분리됩니다. Polyacrylamide gel 내에서 단백질 Sample의 분리는 Gel 내의 Polymer chain 사이에 형성된 Pore를 통해 이..

Introduction▶ 1. Western Blot       - 1-1. Sample preparation       - 1-2. Protein quantification and gel loading     2. Products   1-2. Protein quantification and gel loading  단백질 추출 후 각 Sample은 각 Well당 단백질 Loding volume의 표준화가 필요합니다. 단백질 함량의 정량화는 비색 또는 UV 흡광도(280 nm)측정 방법을 통해 결정할 수 있습니다. Bradford 분석은 단백질에 결합된 Coomassie Brilliant Blue G-250 (465 nm - 595 nm)의 비색 변화와 알려진 농도의 표준 곡선(일반적으로 100-1500 ..

Introduction▶ 2. Western Blot       - 1-1. Sample preparation     3. Products   1-1. Sample preparation(3) 세포 분획화 및 면역 침전 특정 세포 분획(Membrane, Nucleus, Mitochondria 등)을 분리하는 것은 일반적으로 Plasma membrane protein, DNA binding protein 등 세포내 특정 위치에 분포하는 단백질을 분석하기 위한 과정으로 이를 위해 추가적인 Buffer 구성이나 Sample 처리 과정이 필요할 수 있습니다. (ex. 일반적으로 Mitochondria의 분리는 Mitochondria의 형태를 보존하고 막 파괴를 최소화하기 때문에 Dounce homogenizer를..