▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-6. Primary antibody (1st Ab)
- 1-7. Secondary antibody (2nd Ab)
2. Products
1-11. Normalization of target protein abundance
하나의 Well 내에서 더 많은 Sample을 Loding 하는 것과 같은 오류는 Target 단백질의 신호를 증가시켜 데이터 해석을 왜곡할 수 있습니다. 따라서 Target 단백질의 측정값을 Control protein의 측정 값으로 정규화 (Normalization)하여 Loading 편차를 제거할 수 있습니다. 일반적으로 Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(GAPDH) 또는 Beta-actin과 같은 특별한 House-keeping protein (HKP)의 발현이 해당 실험 조건에서 안정적으로 유지된다고 가정하고 Internal loading control로서 사용합니다. 선택된 HKP은 대조군과 실험 샘플 사이에서 일정하게 유지되는 것으로 알려져 있고 수행된 실험 과정이나 조건에 의해 영향을 받지 않는 것으로 입증된 것이어야 합니다. 그러나 이러한 HKP의 정확성과 효율성은 단백질의 Saturation, High background, 선형성 부족과 같은 여러 요인에 따라 달라지며 WB 프로세스 내에서 기술적인 오류로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다.
가령 GAPDH를 검출할 때 고농도에서는 밴드 밀도의 증가가 보이지 않을 수 있습니다. 또한 Beta-actin의 발현은 조직 유형(즉, 근육, 심장, 지방)에 따라 매우 다양할 뿐 아니라 단일 조직 내에서도 균일하지 않은 것으로 밝혀졌습니다. 이러한 발현 차이는 조직 유형 또는 조직 내에서도 자극에 대해 잠재적으로 다르게 반응하는 서로 다른 영역이 있기 때문입니다. 보조 HKP와의 조합으로 사용하면 도움이 될 수 있지만 동일한 문제 중 일부가 여전히 존재할 수 있으며 HKP의 선택이 해석에 영향을 미치지 않음을 입증하는 것이 더 어려워집니다. 실험에 대한 반응으로 HKP 발현에도 예기치 않은 변화가 일어날 수도 있으며, HKP에 대한 일부의 다양한 농도를 기반으로 표적단백질 측정값의 Normalization을 수행한다면 오히려 잠재적으로 관련된 단백질 발현의 변화를 가리거나 혼동할 수 있습니다.
HKP 외에 동일한 목적을 위한 방법 중 하나는 염색된 Gel이나 Membrane에 있는 단백질의 총량을 측정하는 것입니다. 총 단백질을 평가하는 것은 단일 HKP의 발현 변화에 편향되지 않기 때문에 HKP에 비해 뚜렷한 이점을 제공하며, 염색된 Membrane을 사용하는 경우 Blotting process 및 Transfer efficiency도 평가할 수 있습니다. Gel을 Coomassie 염색하거나 형광 검출법을 사용한다면 넓은 농도 범위 (1-40 μg)를 얻을 수 있어서 이전에 논의된 HKP의 제한된 농도 범위 문제를 해결할 수 있습니다. Membrane은 여러 방법 (ex. Ponceau S, Colloidal silver, India ink)으로 전체 단백질을 시각화 할 수 있습니다. 이중 Coomassie 염색은 높은 선형 검출 범위(2.5 - 25 μg)및 염색과정의 편리성으로 가장 많이 사용됩니다.
분석의 마지막 방법은 시험 조건 및 이에 대한 반응으로 나타난 단백질 발현의 변화를 계산하는 것입니다. 이 경우도 역시 Band value (Band intensity)를 Quality control sample value (Correction factor)로 나누어 줌으로써 Loading, Separation, Transfer 등 실험 전반적인 과정에서의 미묘한 변화가 Band intensity, Background등의 형태로 나타나는 영향을 보정합니다.