▶ 2. Western Blot
- Sample preparation
3. Products
2. Sample preparation
(1) Extraction buffer
Sample은 표적 단백질을 가용화하고 보존에 최적화하도록 조성된 완충액에서 균질화되어야 합니다. 단백질의 등전점(중전하를 띠는 pH)에 근접한 균질화 용액을 정확하게 완충(pH 7-9)하도록 하여 아미노산의 활성 잔기의 양전하 또는 음전하를 정확하게 유지함으로써 용해도를 높이고 단백질 침전을 방지하기 위해 필요합니다. Nonionic detergent(ex. Triton X-100)의 사용은 비극성 불용성 단백질의 용해도를 증가시키는 데 유리합니다. 일반적으로 단백질의 정확한 3차 또는 4차 구조의 유지는 비극성 소수성 영역을 단백질의 중심이나 세포막 내부로 향하도록 하기때문에 수용성을 유지할 수 있게 됩니다.
환원제(ex. Dithiothreitol, DTT)는 Cysteine residue 사이의 이황화 결합(S-S Bond)을 분해하는 데 사용되는 한편 SDS는 강력한 Detergent로써 단백질의 소수성 영역을 음전하로 코팅하고 단백질의 Net charge와 상관없이 질량에 비례하여 음전하를 띠게 합니다. 이 과정은 분자 질량에 따라 단백질을 분리하는 데 중요합니다. 다만 환원제는 후속 시료 준비 단계에서 필요로 하는 단백질 농도를 결정하는 데 방해가 될 수 있으므로 단백질 정량 전에는 사용을 제한하거나 최소한의 농도로 처리하는 것이 좋습니다.
특정 단백질의 검출에는 Buffer 성분의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 높은 농도의 NaCl과 Detergent를 통해 세포 내부의 세포 소기관 및 핵막까지 파괴할 수 있습니다. 이러한 변형된 샘플 추출 조건은 DNA 결합 단백질 등 발현량이 적은 단백질을 검출하는 능력을 증가시킬 수 있습니다. 따라서 표적 단백질의 세포 내 위치와 발현량, DNA 결합 여부 등을 고려하여 최적의 Buffer 조건을 결정하여야 합니다.
균질화 과정에서 세포막의 파괴는 적절한 보관 조건에도 불구하고 Protease, Kinase, Phosphatase와 같은 Enzyme을 방출합니다. Enzyme들의 활성으로 인해 표적 단백질을 포함하여 단백질 분해가 발생할 수 있으며, 다양한 Enzyme의 활성을 억제하기 위해 개별적으로 또는 상업적으로 구입 가능한 Enzyme Inhibitor를 첨가해야 합니다.
