[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(3) 세포 분획화 및 면역 침전

   1. Introduction

▶ 2. Western Blot

       - Sample preparation

     3. Products   

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2. Sample preparation

(3) 세포 분획화 및 면역 침전

 특정 세포 분획(Membrane, Nucleus, Mitochondria 등)을 분리하는 것은 일반적으로 Plasma membrane protein, DNA binding protein 등 세포내 특정 위치에 분포하는 단백질을 분석하기 위한 과정으로 이를 위해 추가적인 Buffer 구성이나 Sample 처리 과정이 필요할 수 있습니다. (ex. 일반적으로 Mitochondria의 분리는 Mitochondria의 형태를 보존하고 막 파괴를 최소화하기 때문에 Dounce homogenizer를 사용합니다.) 대부분의 세포 분획물의 분리 방법 중 다수는 각 소기관의 침강 속도 차이를 이용한 차등 원심 분리 기술이 적용되는데 본질적으로 그리고 상대적으로 번거롭습니다. 따라서 세포 분획물의 순도와 특이성을 평가하기 위해 원하는 소기관의 위치와 관련된 단백질에 대해 WB을 수행하여 분획 분리에 대한 상대적 순도를 평가하는 것이 중요합니다. (ex. GAPDH : Cytosolic fraction,  COX-IV or Cytochrome C : Mitochondrial fraction)

 면역 침전법(Immunoprecipitation, IP)의 추가 시료 처리는 발현량이 적은 단백질을 농축하기 위해 사용되며 추가로 잠재적인 Protein-Protein interaction 평가를 가능하게 하기 때문에 SDS-PAGE 전에 수행됩니다. 먼저 원하는 단백질에 특이적인 1차 항체(1stAb)를 균질화 된 Sample에 첨가한 후 Protein A (or G) agarose bead에 결합시켜 면역 복합체를 형성하고, 이를 저속으로 원심 분리하여 Protein-antibody-agarose bead의 복합체를 분리하고, 단백질을 Elution하여 WB에 사용할 수 있습니다. 이를 통해 물리적으로 상호 작용하는 단백질들이 항체 복합체로써 분리된 후 후속 단계로 SDS-PAGE와 Blotting 과정을 거쳐 검출됩니다.

다만, 이 과정에서 1차 항체의 조각들이 Sample을 오염시킬 수도 있음에 유의하여야 합니다. 항체의 변성된 Heavy chain (50 kDa) 및 Light chain(25 kDa)에 해당하는 Band가 강한 Background 형태로 나타나거나 Target band가 변성된 항체 조각에 의해 가려지는 경우가 발생할 수 있음에 유의하여야 합니다. 

 

IP과정과 후속 WB과정에서 나타나는 문제점

 

 

 

 

 

[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(1) Extraction buffer

[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(1) Extraction buffer

 

[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(2) Protein extraction options

[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(2) Protein extraction options