▶ 2. Western Blot
- Sample preparation
3. Products
2. Sample preparation
(2) Protein extraction options
○ Detergent-based Lysis
동물 세포의 용해에 가장 자주 이용되는 방법으로 세포 현탁액을 가볍게 원심분리한 후 Detergent가 포함된 Lysis solution에서 재 현탁 시키는 간단한 과정입니다. 이때 세포를 보호하던 세포막이 용해되고 내부의 세포 구성물들이 방출되게 됩니다. Fibroblast와 같은 부착성 세포의 경우 간단하게는 배양용기 내에서, 또는 Cell scraper 등으로 긁어모아 Tube에 옮긴 뒤 원심 분리 과정을 거친 후 Lysis solution을 첨가합니다. SDS, DOC와 같은 Ionic detergent들은 강력한 Detergent 성분들로 대부분의 단백질들을 Monomeric protein으로 분리시켜 WB 및 Size 분석용 Sample 준비에 주로 사용됩니다. Triton X-100, Nonyl phenoxypolyethoxylethanol (NP40)와 같은 Non-ionic detergent 또는 3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate (CHAPS)와 같은 Zwitterionic detergent를 사용하면 비교적 Mild한 조건에서 목적 단백질의 변성을 최소화하여 단백질의 활성을 확인해야 할 실험에 사용되는 Sample을 준비할 수 있습니다.
○ Freeze/Thaw lysis
부유성의 동물 세포와 박테리아 용해에 적당하며 간단하고 비용이 적게 듭니다. 액체 질소를 사용하여 급격한 동결과 해동을 반복하면 동결 시 생기는 세포 내부의 결정 등에 의한 물리적 충격에 의하여 세포가 분해되는 원리로 종종 효소를 이용한 Lysis와 병행하여 사용합니다.
○ Osmotic shock
부유성 동물세포와 박테리아 용해에 주로 사용하며 Detergent를 사용하지 않고 세포 외부 환경에 급격한 삼투압 변화를 주어 그 충격으로 세포를 용해시킵니다. 그러나 Osmotic shock는 다른 방식보다 Lysis 효율이 낮아 단독 사용보다는 Mechanical lysis 혹은 Enzymatic digestion과 병행하기도 합니다. 이 방식은 세포 용해 후 세포 내 구조물별로 Sample을 분리 추출하고자 할 경우 유용합니다.
○ Ultrasonication
소량의 Cell로부터 단백질 Sample들을 분리하고자 할 때 사용합니다. 20-50 kHz의 초음파를 발생하는 Probe를 Sample에 넣으면 Probe 인근 국소부위에 압력이 매우 낮아져 세포막이 붕괴됩니다. 이때 높은 열이 발생되며, Sample 손상을 방지하기 위해 간헐적으로 작동하고 작동 중간마다 Ice로 Sample을 냉각시켜 주어야 합니다. 비교적 간단한 방법이지만 열 발생에 유의해야하고 목적하는 단백질이 초음파에 민감한 경우 사용이 제한됩니다.
○ Mechanical methods
- Homogenization : 냉각시킨 Buffer 내에서 샘플을 회전하는 분쇄기의 날을 이용하여 물리적으로 파쇄하는 방법입니다.
- Mortar and Pestle: 막자사발, 알루미늄 분말이나 모래 등을 이용하여 냉동된 Sample을 분쇄하는 방법으로, 가령 액체질소 내에서 Sample을 단단하게 얼린 후 막자사발 등으로 갈아서 파쇄시킬 수 있습니다.
- Glass bead milling : 주로 다양한 종류의 박테리아의 용해에 사용되며 미세한 Glass bead를 이용하여 물리적으로 세포벽을 파괴하는 방법입니다.
○ Enzymatic digestion
Bacteria, Yeast, Plant cell처럼 세포막이 또 다른 단단한 외벽에 의해 보호 되어있는 세포들에 주로 이용하며 콜라겐이나 섬유질이 많은 조직 Sample에도 사용될 수 있습니다. 사용되는 Enzyme은 이 구조물들을 분해하는 데만 이용되므로 이후 Homogenization, Sonication, Lysis buffer등을 이용해 세포 전체를 다시 용해시키는 과정을 거쳐야 합니다. 일반적으로 Bacterial cell은 Lysozyme, Yeast cell은 Zymolyase를 사용합니다.
이와 같은 조성의 Buffer를 포함하여 WB을 위해 Sample을 분리 추출하는 다양한 방법들이 아래 표에 요약되어 있습니다.
(좌) RIPA Buffer : Non-ionic/ionic Detergent를 이용하여 효과적으로 세포를 Lysis 할 수 있는 Lysis Buffer
[Western Blot -Western Blotting의 기술적 고려사항과 응용-] 2. Sample preparation_(1) Extraction buffer
1. Introduction▶ 2. Western Blot - Sample preparation 3. Products 2. Sample preparation (1) Extraction buffer Sample은 표적 단백질을 가용화하고 보존에 최적화하도록 조성된 완충액에서 균질
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