▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-6. Primary antibody (1st Ab)
- 1-7. Secondary antibody (2nd)
2. Products
1-8. Detection
WB 검출의 일반적인 원리는 Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)와 같은 여러 항체 기반 분석과 동일합니다. 일반적으로 2차 항체는 방사성 동위원소 또는 형광물질 등의 검출 가능한 화학물질 또는 발색을 유도하는 효소와 접합됩니다. 역사적으로는 X-ray Film에 노출되는 방사성 동위원소 혹은 효소였으나 지금은 일반적으로 카메라나 전용 이미징 장치로 감지되는 효소 또는 Probe입니다. 가장 일반적으로 사용되는 두 가지 효소는 Alkaline phosphatase(AP)와 Horseradish peroxidase(HRP)입니다. AP와 HRP는 각각 비색 또는 화학 발광 검출에 사용할 수 있습니다. HRP가 접합된 항체를 사용할 경우 항체의 보존제로 사용되는 Sodium azide가 효소의 활성을 파괴하므로 Blotting 및 검출에 사용되는 Buffer 등의 용액에는 Sodium azide가 포함되지 않아야 하며 노출 전에 Membrane을 충분히 세척해야 합니다. 초기의 비색 검출법은 HRP의 기질(예: 3,3-diaminobenzidine:DAB)을 산화시켜 갈색 불용성 물질을 생성하도록 하였습니다. 그런 다음 전용 Imager 또는 기존 사무용 스캐너로 Blot을 스캔하고 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화하였습니다. 이러한 형태 검출의 주요 단점은 화학반응을 중단해야 하므로 정량 전에 반응 시간, 온도 등에 관련된 최적의 반응 조건을 결정해야 한다는 것입니다.
개선된 방법인 화학 발광 검출법에서 HRP는 과산화수소의 존재하에 Luminol을 425 nm에서 빛을 방출하는 3-aminophthalate로 산화시키는 반응을 매개합니다. Chemiluminescent blot은 기질과 함께 3-5분 동안 반응한 후에 최적의 이미지로 나타나며 몇 시간 동안 Signal을 생성할 수 있습니다. 이 검출 방법의 주요 이점은 Blot을 다시 세척하고 기질에 반복적으로 노출시켜 최적의 검출 조건을 찾을 수 있다는 것입니다. Blot은 Film에 노출시킨 다음 현상 과정을 거치거나 특수 검출 시스템(예: Chemidoc, Odyssey)을 사용하게 되는데 최근에는 후자가 가장 일반적이고 정확한 방식입니다. 그러나 Blot의 시각화를 위한 이러한 옵션 모두 비색 감지보다 더 많은 비용과 장비를 필요로 합니다. Blot의 정량화는 광 검출 방법에 따라 달라지는데, 감광성 필름의 경우 노출 및 현상 후 후속 스캐닝 및 Image J가 일반적으로 사용됩니다.
비색 검출과 화학 발광 검출 방법들이 가지고 있는 단점은 형광 물질이 접합되어 있는 2차 항체를 사용함으로써 많은 부분 해결 가능합니다. 이 방법에 있어서는 추가적인 화학 반응이 필요 없이 전용 분석 장비를 통해 쉽게 검출할 수 있습니다. 형광 기반 이미징은 화학 발광(125pg)에 비해 더 큰 영역의 감지 범위(250-500pg)를 가지고 있습니다. 형광 접합 항체의 또 다른 이점은 서로 다른 종에서 유래된 1차 항체 외 다른 파장의 형광이 접합된 2차 항체들의 조합으로 동일한 Blot에 대해 다중 노출을 통한 검출이 가능하다는 것 입니다.
적은 양의 표적 단백질을 검출하고자 하는 경우 감도를 높이기 위해 몇 가지 해법이 제시됩니다.
