▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-6. Primary antibody (1st Ab)
2. Products
1-7. Secondary antibody (2nd)
2차 항체(2nd Ab)는 1st Ab에 의해 결합된 표적 항원의 간접 검출에 필요합니다. 일반적으로 1차 항체는 검출을 위한 Label (ex. Horseradish peroxidase, HRP)이 접합되지 않으므로 간접적인 Label로써 1차 항체의 Fc (Fragment crystallizable) region에 결합할 수 있는 2차 항체가 필요합니다. 2차 항체의 장점은 하나의 1차 항체에 여러 개의 2차 접합 항체가 결합함으로써 항체의 시그널을 증폭하는 능력입니다.
2차 항체의 선택은 우선적으로 1차 항체의 Isotype과 어느 동물에서 생산된 것인지에 따라 선택이 가능합니다. 항체 Heavy chain구조의 다양성은 그 항체의 기능과 분류를 결정합니다. 포유동물의 항체는 IgM, IgD, IgE, IgA와 IgG의 5가지 클래스 중 하나이며, 그 중 IgG는 Rat, Mouse 및 Human 등에서 여러 하위 클래스로 세분화됩니다. (ex. IgG2a, IgG2b). Mouse 또는 Rat 에서 유래하는 1차 Ab는 같은 Isotype 에 대해 특이성을 갖는 2차 항체가 필요할 수 있습니다. 그러나 토끼의 IgG는 단일 Isotype만 생성하므로 2차 항체 사용에 있어서 광범위한 특이성이 허용됩니다. 예를 들어, Rabbit에서 유래한 IgG
1차 Ab는 단순히 Anti-rabbit IgG 를 필요로 하는 반면, Mouse IgG2a는 IgG2a Isotype에 특이적인 2차 항체가 필요합니다. WB에 1차 항체로서 Rabbit IgG의 사용은 일반적이며 이 경우 Anti-rabbit IgG 2차 항체를 사용할 경우 다중 검출이 가능하다는 것을 의미합니다. 한편 1차 항체를 서로 다른 동물에서 유래된 것을 사용할 경우 다양한 파장의 형광이 접합된 2차 항체들을 사용함으로써 하나의 Membrane에서 각각의 표적 단백질에 대해 서로 다른 신호를 생성하는 Blot을 얻게 될 수 있습니다.
비록 2차 항체는 1차 항체의 특정 Epitope와 결합하지만, 다른 분리된 단백질에 존재하는 유사한 펩타이드 서열로 인해 비특이적인 교차 반응이 일어날 수 있으며 이러한 현상은 Blocking에 사용된 단백질에 대해서도 발생할 수 있습니다. 따라서 1차 항체를 처리하지 않은 음성 대조군을 사용하여 관찰된 Band가 1차 항체의 비특이적인 반응으로 인한 결과가 아님을 확인해야 합니다. 2차 항체의 처리 농도(최적 희석 조건)는 표적 단백질의 발현 수준과 1차 항체의 선택에 따라 달라집니다. 예를 들어, GAPDH는 매우 높은 수준으로 발현되므로, Signal saturationd을 방지하기 위해 더 많이 희석하여 사용하여야 합니다. 그러나 일반적으로 항체 공급업체의 권장 사항이 적절한 경우가 많습니다. 이후, 희석 곡선을 사용하여 검출 대상에 필요한 2차 항체의 최적 농도를 결정할 수 있습니다.
2차 항체 희석 용액은 일반적으로 1차 항체와 동일한 Buffer 및 Blocking solution과 유사하게 사용되지만, 높은 Background가 발생하는 경우 최적화가 필요할 수 있습니다. 1차 항체와 달리 2차 항체의 반응은 일반적으로 실온에서 더 짧은 시간 (일반적으로 1시간)동안 수행됩니다. 경우에 따라 더 긴 Incubation이 필요할 수 있지만 이것은 Membrane 내에서 비특이적 결합으로 이어져 더 높은 Background를 생성할 수 있습니다. 사용상 편의성을 위해 배양 시간은 유지하면서 표적 단백질의 특성에 따라 항체 농도를 변경하는 것을 추천합니다.