▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
2. Products
1-5. Blocking
WB을 수행 시 Blocking step은 항체(1st Ab 또는 2nd Ab)와 Membrane의 비특이적 결합을 방지할 수 있는 매우 중요한 과정입니다. Membrane은 Sample 단백질뿐만 아니라 항체와 같은 결합 단백질에 대해서도 높은 친화성을 갖기 때문에 적절한 Membrane
blocking은 후속 검출 단계에서 Background를 감소시킬 수 있습니다. Blocking 단계에 있어서 다양한 방법이 적용되고 있으며 각각 고유한 장점과 단점이 있습니다. TBST(Tris Buffer Saline Tween-20)에 희석한 Non-fat dry milk가 저렴하고 쉽게 구입할 수 있어 자주 사용되지만, 우유 단백질이 모든 항체와 호환되는 것은 아닙니다. 예를 들어 우유에는 Phospho-protein인 Casein과 Biotin이 함유되어 있어 Anti-phosphoprotein antibody를 사용하는 경우 우유에 존재하는 Casein과 교차 반응할 수 있으므로 BSA (Bovine Serum Albumin)를 사용하는 것이 좋습니다.
가장 일반적으로 사용되는 Blocking buffer는 TBST 또는 PBST 기반 Buffer에 약 2.5–5% (w/v)의 Skim milk 또는 BSA를 녹여 사용합니다. Blocking을 위한 다른 원료는 고순도 비동물성 단백질 (ex. 정제된 Casein)을 사용하는 것이지만 비용적 부담이 있습니다. Blocking 조건에 대한 적절한 지침은 일반적으로 항체 관련 정보와 함께 제조사에서 제공되기도 합니다.
이상적인 Blocking buffer는 비특이적 상호작용하는 모든 부위에 결합하며 항체와 표적 단백질에 대한 상호작용에 영향을 주지 않고 모든 Background를 제거합니다. Blocking buffer의 선택은 항원 자체와 2차 항체에 따라 달라집니다. 예를 들어, Alkaline phosphatase가 Conjugation된 2차 항체 사용 시 PBS 기반의 Buffer 사용은 Sodium phosphate (일부 용액에서는 Potassium phosphate 포함)의 존재로 인해 Phosphatase를 방해하므로 TBST를 선택해야 합니다. 중간 단계에 PBS를 사용하는 경우 Substrate를 첨가하기 전에 Membrane을 TBST로 충분히 세척하여 Sodium phosphate를 제거해야 합니다.
WB 결과에 영향을 줄 수 있는 것은 Blocking buffer의 선택만이 아닙니다. Blocking buffer의 양과 처리 시간(1시간에서 Overnight 까지 다양)도 중요한 요소입니다. Blocking buffer의 양이 너무 적거나 (낮은 농도) 처리시간이 너무 짧으면 1차 항체의 비특이적 결합과 Background 및 Signal-noise ratio를 증가시킵니다. 반대로, 처리 시간이 너무 길거나 과량의 Blocking solution을 사용하면 항원-항체 상호작용이 방해를 받아 Signal-noise ratio가 감소할 수 있습니다. 비특이적 Background를 최소화하고 Anti phosphoprotein antibody (Monoclonal, Polyclonal or Biotin conjugated antibody)의 면역반응을 촉진하기 위해 일반적으로 5% BSA, 5% Amicase, 5% Blocking agent in TBST (0.05% Tween 20) 성분으로 구성된 용액을 사용하여 실온에서 45분 동안 진행하는 것이 권장됩니다. 다만 일반적인 Blocking solution과 마찬가지로 1.5시간 이상 Incubation 하면 신호 강도(Signal-noise ratio)가 감소하고 30분 이하에서는 높은 Background가 나타납니다. 따라서 Blocking solution을 최적화하기 위해 가장 기본적으로는 5% Skim-milk solution in TBST를 사용하는 것이 좋습니다. Incubation을 1 시간 가량 진행한 뒤 Background를 확인하고 Blocking solution의 종류와 농도를 재조정합니다. 각 Antigen-antibody 쌍이 고유한 특성을 가지므로 모든 WB 분석에 이상적인 Blocking solution은 없습니다. 따라서 선택된 Blocking system은 위의 고려 사항에 맞춰 개별 실험목적에 대해 최적화되어야 합니다.