▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
- 1-4. Electrotransfer
2. Products
1-4. Electrotransfer
Gel 상에서 분리된 단백질은 항체를 이용하여 검출하는데, 이를 위해 단백질에 대한 높은 친화력과 내구성을 가지는 Membrane으로 전기적 힘을 이용하여 단백질을 이동 및 고정시킵니다. PAGE와 동일한 원리를 이용하여, Gel에 음으로 하전된 단백질은 Buffer에 담근 상태에서 측면 전류가 가해질 때 Membrane으로 이동합니다.(Wet transfer) Membrane은 단백질이 Transfer되어 거울상 이미지를 만들 수 있도록 Gel에 직접 맞닿게 배치합니다. Membrane은 일반적으로 Nitrocellulose (NC) 또는 Polyvinylidene difluoride (PVDF) 재질을 사용합니다. NC는 소수성이 아니기 때문에 쉽게 수화되므로 Wet 또는 Semi-dry transfer 방법에 적용되어 왔으나 깨지기 쉬운 특성상 Stripping/Reprobing과 같은 단백질의 추가 Detection 기법이 많이 사용되는 최근 실험에 적용하기 어려워졌습니다. 더 내구성이 강한 소수성 PVDF membrane은 화학적으로 더 안정적이고 견고하기 때문에 Stripping /Reprobing을 포함한 실험에 더 적합합니다. 그러나 PVDF membrane은 Buffer의 침투와 단백질의 결합을 용이하게 하기 위해 사전에 Methanol을 처리하여 activation 시켜야 하며, 소수성 상호 작용을 통해 단백질에 결합하고 다른 재질의 Membrane보다 더 많은 양의 단백질을 결합시키는 데 유리하지만, Membrane-antibody의 비특이적 상호작용이 발생할 가능성이 NC보다 더 높아 결과적으로 충분한 세척 과정이 필요합니다.
Membrane pore size(0.45 - 0.025 μm)는 단백질 사이즈에 따른 결합 능력에 영향을 미치게 됩니다. 예를 들어 Cytochrome C (12.5 kDa)와 같은 작은 단백질은 Pore size가 0.45 μm인 Membrane에서 낮은 결합 능력을 가집니다. 따라서 작은 분자량의 단백질 (<20 kDa)을 검출하려면 더 많은 양의 단백질이 결합할 수 있도록 더 작은 Pore size의 Membrane을 사용하는 것이 좋습니다. PVDF membrane으로의 단백질 전달은 높은 SDS 농도에 의해 억제될 수 있으므로, Transfer 전에 Gel을 증류수에서 충분히 세척한 후 Transfer buffer에서 약 5분 정도 평형을 유지시켜 과량의 SDS가 제거되도록 합니다.
Transfer 방법은 다양합니다. 전통적인 Wet transfer는 Cassette 뒷면, Fiber pad, Blotting paper, Polyacrylamide gel, Membrane, Blotting paper, Cassette 전면을 샌드위치 형태로 조립하여 Transfer tank 내에서 양극과 음극 사이에 잠기게 됩니다. 기존에 Wet transfer는 22시간 동안 진행되었지만, 현재의 Transfer는 대부분 60-90분 동안 진행합니다. 이 시간은 PAGE와 마찬가지로 검출하고자 하는 단백질의 크기에 따라 달라서 단백질의 크기가 작을수록 이동에 더 적은 시간이 필요할 수 있습니다. 한편, Transfer time이 충분하지 않으면 대부분의 단백질이 Gel 내에 남아 있기 때문에 이후 단백질 검출 시 Signal이 없거나 약하게 됩니다. 반대로, 과도한 Transfer time은 단백질이 Gel과 Membrane을 통과해버려 마찬가지로 검출 Signal 강도가 없거나 약하게 됩니다. Gel staining(ex. Coomassie/silver/Ponceau stain 또는 Stain-free gel의 사용)을 통해 Membrane에 Transfer 되지 않고 Gel 내에 남아있는 단백질을 가시화하여 Transfer 효율을 확인할 수 있습니다.
Semi-dry transfer 기법은 개별 요구 사항 또는 시간 제약이 있는 경우보다 빠른 Transfer time (1시간 이상 단축)이 장점인 기법입니다. 여러 회사에서 판매하고 있는 Semi-dry transfer 기기는 사용이 쉬울 뿐만 아니라 다양한 크기의 단백질을 전달할 수 있으며 비교적 저렴한 시약을 사용합니다. 최근에 개발된 Trans-Blot®Turbo™ Transfer system (Bio-Rad)을 사용하면 훨씬 더 빠른 Transfer를 진행할 수 있지만 일정 크기 이상의 단백질(>100 kDa)은 잘 작동하지 않을 수 있으며 더 비싼 소모품을 필요로 합니다.
Transfer buffer의 조성은 특히 고분자량 단백질의 전달 효율에 큰 영향을 미칩니다. 일반적으로 Wet transfer buffer는 pH 8.3 Tris-base buffer에 Glycine을 사용하며 산성 또는 염기성 용액을 추가하여 pH를 조정하게 될 경우, 더 높은 이온 함량을 가지게 되어 전도도가 높아져 용액의 온도 증가 및 Background 간섭 등 비효율적인 Transfer의 원인이 됩니다.
Transfer buffer는 고전류로 인한 과열이나 Membrane 변형을 방지하기 위해 일반적으로 Ice block 내에 Transfer tank를 두어 실험 진행 동안 지속적으로 냉각시킵니다. Methanol은 단백질에 대한 Membrane의 결합 능력을 증가시키고 Gel 팽창을 방지하는 목적으로 Original transfer buffer에서 사용되었습니다. 그러나 Buffer에 Methanol을 포함하면 Gel내에 Pore size가 감소하므로 분자량이 더 큰 단백질(>100 kDa)의 전달효율이 떨어지게 되어 사이즈가 큰 단백질을 검출할 때는 Methanol 사용을 배제하는 것이 좋습니다.
WB을 통해 분석하고자 하는 대부분의 단백질의 경우 일반적으로 이온 강도가 낮은 완충액과 낮은 전류를 사용하는 것이 좋습니다. 이러한 일반 규칙을 따르면 매우 성공적인 Transfer의 가능성이 높습니다. Ponceau, Coomassie등을 사용한 Membrane 또는 Gel의 가역적 염색은 Transfer의 효율 및 결과를 쉽게 확인 할 수 있도록 도와줍니다. 균일하지 않은 Loading은 여러 단백질 Band나 Lane에서 눈에 띄는 염색 강도의 차이로 표시됩니다. 이러한 불균일성은 Sample 단백질의 농도나 양이 동일하지 않거나 Well에 분주된 Sample volume의 차이로 인한 것일 수 있습니다. 전자의 경우 단백질 추출물의 농도를 재분석하여야 할 필요가 있습니다. 효율적이고 완전한 Transfer가 이루어지지 않으면, 정확한 정량 및 분석에 영향을 주게 될 것 입니다.
