▶ 2. Western Blot
- Protein quantification and gel loading
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3. Protein quantification and gel loading
단백질 추출 후 각 Sample은 각 Well당 단백질 Loding volume의 표준화가 필요합니다. 단백질 함량의 정량화는 비색 또는 UV 흡광도(280 nm)측정 방법을 통해 결정할 수 있습니다. Bradford 분석은 단백질에 결합된 Coomassie Brilliant Blue G-250 (465 nm - 595 nm)의 비색 변화와 알려진 농도의 표준 곡선(일반적으로 100-1500 ㎍/㎖)을 활용하여 측정할 수 있습니다. 이 분석법은 기본적인 분광 광도계만 있으면 실험이 가능할 뿐만 아니라 수행 하기 쉽고 반응이 빠르며 (~2분) 결합 생성물은 실온에서 1시간까지 안정합니다. Lowry, Bicinchoninic acid 및 Ortho-phthalaldehyde 분석과 같은 유사한 생화학적 비색 특성을 기반으로 하는 여러 다른 방법도 WB을 위한 단백질 농도 측정에 이용됩니다.
그러나 비색 분석법은 다른 최신 방법(ex. UV 흡광도)보다 더 많은 Sample이 필요하고 Sample 처리 또는 표준 곡선 준비 과정에서 Pipetting 오류가 발생하기 쉬우며 완충액 성분이나 (ex.β-mercaptoethanol, β-ME) 헤모글로빈과 같은 조직 구성 성분에 의해 영향을 받는 단점이 있습니다. 마이크로 분광 광도계(ex. Nanodrop) 장비를 사용하여 UV 흡수를 통해 단백질 함량을 측정하는 것은 적은 양의 Sample만을 필요로 하고(0.5-2 ㎕), 넓은 정량 범위(0.1-3,000 ㎍/280 nm), 그리고 측정 완료 후 완전한 Sample 회수의 장점이 있기 때문에 보다 적합할 수 있습니다. 이 방법은 방향족 고리를 포함하는 아미노산(즉, Phenylalanine, Tyrosine 및 Tryptopan 등)에 의해 UV 흡광도 280 nm에서 정확한 정량을 가능하게 합니다.
한편, 샘플이 흡광도 측정에 영향을 미치는 불용성 및 가용성 단백질을 모두 포함하는 경우 잘못된 측정이 발생할 수 있으며 이는 Sample 균질성의 중요성을 보여줍니다. 또한 재현성을 보장하기 위해 알려진 단백질 농도의 표준 곡선을 Batch 별로 관리해야 합니다. 정량을 마친 후 Aliquot된 Sample은 Gel loading을 위해 적절한 Buffer를 추가하여 원하는 농도로 희석할 수 있습니다.
시료 처리의 마지막 단계는 단백질의 2차, 3차 구조를 단순한 1차 구조로 변성시키는 과정으로, 이론적으로 단백질을 아미노산의 선형 배열에 따른 크기를 기반으로 분리할 수 있게 됩니다. 이를 위해 표준 농도의 샘플을 Laemmli buffer와 혼합하는데 이때 Buffer의 구성 성분은 여러 가지 중요한 기능을 합니다. Cystein residue를 포함하는 Thiol은 이황화 결합을 형성하여 단백질 Folding을 제어하고 단백질의 2차, 3차 구조를 안정화 시키는 역할을 하고 β-ME, DTT 또는 TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)와 같은 환원제의 첨가는 이황화 결합을 절단하여 2차 및 3차 구조를 불안정하게 하여 단백질을 1차 구조로 펼칩니다. (β-ME는 휘발성 때문에 사용 직전에 첨가해야하며 또한, 이들 Denaturing Reagent를 고농도로 처리할 경우 단백질의 정량 분석을 방해할 수 있으므로 단백질 정량화 후에 추가해야 합니다.) SDS의 첨가는 전류를 흘려주었을 때 단백질이 분리가 될 수 있도록 모든 단백질 R그룹 (기능성 아미노산 그룹)을 음전하로 코팅합니다. SDS가 단백질의 1차 구조 (단백질 1 g당 1.4 g)에 결합함에 따라 단백질의 전체 전하가 분자량에 비례하여 음전하를 띠게 되며, 이것이 바로 Polyacrylamide gel을 이용하는 단백질 분리의 기본적인 원리입니다.
일반적으로 Lane 당 총 세포 단백질 10-100 ㎍ 이 Loading 됩니다. 그러나 이것은 일반적인 Standard gel에 적용될 경우이며 실제로는 Gel의 두께와 Lane 너비, 단백질의 예상 발현량, 그리고 검출 방법과 효율 등 여러 요인을 고려하여 실험자가 결정해야 합니다.
표적 단백질 식별을 위해 단백질은 먼저 1차 구조 및 아미노산 서열에 따라 질량별로 분리된 후 이미 질량을 알고 있는 다양한 사이즈의 단백질 혼합물을 포함하는 Protein standard와 상대적 비교를 통해 질량을 확인할 수 있습니다. 이에 필요한 Protein standard의 선택은 여러 분석 요구 사항과 함께 해당 분자량 영역 근처의 Resolution에 따라 결정됩니다. Protein standard는 분리된 단백질을 쉽게 시각화하고 Membrane으로의 효과적인 전달을 확인하기 위해 Pre-staining용으로 사용하기도 하며, 후속 과정에서 1st Ab 또는 2nd Ab 반응 시 이에 대한 결합 부위를 포함할 수 있도록 설계하면 WB의 검출 및 분석 과정을 보다 편리하게 최적화할 수 있습니다. (ex. Western standard marker)