▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
2. Products
1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
앞선 샘플 준비 단계에서 2차, 3차 구조가 변성되고 분자량에 비례하여 음전하를 띠도록 준비된 단백질 Sample들은 PAGE를 수행하여 분리됩니다. Polyacrylamide gel 내에서 단백질 Sample의 분리는 Gel 내의 Polymer chain 사이에 형성된 Pore를 통해 이동할 때 단백질의 마찰 저항으로 인해 이뤄집니다. Polyacrylamide gel은 Acrylamide monomer와 N,N-methylenebisacrylamide (Bis-acrylamide) monomer의 가교를 통해 균일한 Size의 Pore가 생기게 되며 Pore size는 두 Monomer와 가교제의 비율로 조절할 수 있습니다. 전류가 흐르면 단백질은 Gel 구조 내의 Pore를 통해 이동하게 되는데 이때 Bis-acrylamide 농도를 변경하면 Pore size가 조절되고 결과적으로 더 큰 단백질이 보다 쉽게 이동할 수 있게 됩니다. 더 높은 Acrylamide 농도(ex. 20%)를 가진 Gel에서는 분자량이 큰 단백질의 이동이 작은 크기의 단백질에 비해 더 높은 비율로 방해받게 되므로 상대적으로 분자량이 낮은 단백질을 잘 분리합니다. 마찬가지로 분리하고자 하는 단백질의 분자량이 큰 경우 최적의 분리능을 위해 더 낮은 농도의 Gel (ex. 7.5%)이 필요할 수 있습니다. 혹은 다양한 Size의 단백질을 균일하게 분리할 수 있는 Gradient gel (ex. 4 – 12%)을 이용하기도 합니다. Agarose와 같은 다른 Gel 유형을 사용할 수도 있지만 일반적이지 않으며 수천 kDa의 매우 큰 분자량의 단백질을 분리할 경우에 제한적으로 사용되기도 합니다. 결과적으로, 가교제의 농도와 분리하고자 하는 단백질의 분자량은 Gel 선택을 위한 주된 결정 요인으로, 적절한 선택을 통해 효율적인 이동과 최적의 밴드 분리능을 갖도록 하여야 합니다.
DNA 전기 영동의 경우 DNA를 분리하기 위해 Buffer와 Gel 내의 일정한 pH를 사용하는 반면, 단백질 전기 영동은 불연속적인 Buffer system이 필요합니다. 불연속 시스템은 분리되는 단백질이 뚜렷한 분리능을 갖도록 2개의 영역으로 분리된 Gel을 사용하며, 각각 더 큰 Pore size를 갖는 "Stacking gel"과 상대적으로 작은 Pore size를 갖는 "Resolve or Separating gel"로 구성됩니다. 이 두 개 영역의 Gel은 1) Pore size의 차이와 2) pH 차이를 이용하여 타겟 단백질을 분리합니다. 첫 번째로 Gel에 Loading 된 단백질은 Separating gel에 도달할 때까지 큰 Pore Size로 구성된 Stacking gel을 통해 빠르게 이동하고, 그 후 작은 Pore size의 Gel에 도달하면 이동이 느려져 단백질이 함께 압축된 형태로 쌓이게 합니다.
두 번째로 불연속 완충용액 시스템은 서로 다른 pH로 제작된 Stacking gel (pH 6.8)과 Separating gel (pH 8.8)에서 진행됩니다. Running buffer에 첨가된 Glycine은 pI가 6.2로 pH 6.8인 Stacking gel에서 약한 음전하를 가지며, Chloride는 강한 음전하를 가지기 때문에 High voltage gradient가 형성되고, 이로 인해 Glycine–단백질–Chloride의 순서로 Stacking gel을 이동하게 되는데, 이때 단백질이 축적되어 이동하면서 분자량 크기와 상관없이 이동하게 됩니다. pH 8.8인 Separating gel에서는 Glycine이 강한 음전하를 가지게 되어 Glycine과 Chloride 간의 High voltage gradient가 사라지게 되고, 이때부터 단백질은 분자량에 따라 분리되기 시작합니다. 샘플 조성에 따라 더 크거나 작은 분자량의 단백질이 잘 분리될 수 있도록 변형된 Buffer system을 사용할 수도 있습니다. 예를 들어, Bis-tris system은 Glycine 대신 MOPS 또는 MES를 사용하며 이를 통해 각각 중간 크기(~75 kDa) 또는 더 작은(<36 kDa) 단백질에 대해 우수한 분리능을 얻을 수 있습니다. Bis-Tris gel은 pH 6.8에서 만들어지는데, 산성 특성으로 인해 Acrylamide가 가수분해되지 않아 Tris-HCl gel에 비해 보관 수명이 훨씬 더 깁니다.
일반적으로 단백질 이동은 전압과 정비례 관계를 보이므로 전기 영동은 정전류가 아닌 정전압을 사용하여 수행됩니다. 전류는 전압과 저항에 따라 달라지는데 Buffer의 온도와 같은 이유로 저항의 변화가 발생할 경우 전압이 변동되기 때문에 정전류를 사용하면 단백질 이동을 제어하기 어려워집니다. 기기에 따라, 전기영동은 일반적으로 80-100 V로 Stacking gel을 통과할 때까지 진행하며 이후 120-150 V로 변경하여 약 60-90분 동안 수행합니다. 그러나 단백질 분자량의 크기에 따라 전압과 시간은 최적의 조건으로 변화시킬 필요가 있습니다.
