▶ 1. Western Blot
- 1-2. Protein quantification and gel loading
- 1-3. Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE)
2. Products
1-6. Primary antibody (1st Ab)
WB의 원리는 하나 이상의 표적에 대한 항체(Ab)의 인식 및 결합을 통해 단백질을 검출하는 것입니다. 이 상호작용은 항원(Protein)의 일부(Epitope)와 항체의 항원 결합 영역(Fab)에 존재하는 특이적 인식 부위(Paratope) 사이에 매우 특이적인 결합력을 필요로 합니다. 1차 항체는 표적 단백질을 감지할 수 있을 만큼 충분히 특이적이고 민감한 것인지 철저하게 평가되고 검증되어야 합니다.
단백질 샘플을 변성시킨 후 SDS-PAGE를 진행하면 Epitope의 노출 및 가용성이 변경되어 항체 결합 친화도에 영향을 미칠 수 있으므로 항체가 온전 또는 변성된 단백질에 대해 특이적인지 확인하는 것도 중요합니다. 어떤 경우에는 "Native-specific" Monoclonal Ab를 사용해야 할 수도 있습니다. Target peptide의 서열은 특이성 및 결합 영역의 확인이 가능하도록 항체 공급자로부터 제공 받을 수도 있습니다. 전통적으로 1st Ab는 정제된 표적 단백질을 직접 사용하여 숙주의 면역화를 통해 생성되는 반면, 현대 접근법은 Synthetic peptide를 사용하여 짧은 변성된 8-10개 아미노산 서열에 대해 Ab를 생성합니다.
분리 및 정제는 일반적으로 Affinity chromatography 또는 Anion exchange filtration에 의해 이루어집니다. 항체의 Species cross reactivity에 관한 정보는 공급업체를 통해서만 제공되는 경우가 많지만, 궁극적으로는 항원의 영역에 달려 있습니다. 1차 항체를 선택할 때 공급업체마다 다른 형태가 제공될 수 있는데 대부분 표적 단백질의 고유한 항원에 결합하여 단백질의 발현량을 정확하게 평가할 수 있도록 합니다. 그러나 완벽하진 않기 때문에 해당 항체를 사용하는 참고 문헌의 평가를 참고하시기 바랍니다. 일부 단백질은 상동성이어서 다른 종과 동일하거나 유사한 서열을 포함합니다. 따라서 만약 1차 항체가 이 서열을 가진 Epitope에 특이적이면 다른 종에 대해서도 사용할 수 있습니다. 예를 들어 GAPDH 1차 항체는 Human, Rat 및 Mouse 조직에 공통적으로 사용될 수 있습니다.
1차 항체의 특이성과 성능은 Monoclonal(mAb)인지 Polyclonal(pAb)인지에 따라 달라지며 각각 단점/장점이 있습니다. pAb는 항원의 여러 Epitope 영역을 인식하는 다양한 B-cell 계통에서 생성됩니다. 일반적으로 비용 대비 효율적이며 관심 단백질을 표적으로 할 수 있는 더 많은 항체 분자를 제공하여 분석 시 더 높은 수준의 감도를 생성합니다. 그러나 이로 인해 비특이적 결합의 가능성도 더 커지는 단점도 가지게 됩니다. 반대로, mAb는 Mono-specific epitope에 대해 생성된 단일 세포 계통에서 생성되기 때문에 항원에 대해 매우 일관되고 특이적 결합을 제공합니다.
표적 단백질의 1차 아미노산 서열에 따라 유사한 Epitope가 단백질 분해 산물 또는 다른 Isoform 내에 존재할 수 있으며 이로 인해 추가적인 Band를 나타낼 수 있습니다. 분해 산물 또는 Isoform은 그만큼 낮아진 분자량으로 인해 Target band보다 먼저 이동합니다. 이때 각 Band가 충분히 분리되어있는 경우 (즉, 분자량이 다른 경우) 유사 Epitope에 대한 1st Ab의 친화도가 데이터 해석을 방해하지 않을 수 있습니다. 즉, 특이성 문제는 여전히 남지만 두 개의 Isoform과 적절한 대조군 사이의 충분한 전기영동 분리가 이루어진다면 Target protein은 정확하게 식별될 수 있습니다. 다만 일부 단백질은 예측할 수 없는 영역으로 이동할 수 있으므로 Band 분자량 평가가 항상 적합한 것은 아닙니다. 결국 표적 단백질의 이동 특성을 아는 것이 중요하며, 예상치 못한 Band가 발생하는 경우 문헌 조사가 필요할 수 있습니다.